0 引言
脂肪酶(lipase)全称三酰基甘油水解酶，是一类特殊的酰基水解酶，可在油水界面处催化酯水解、醇解、酯合成、酯交换等有机反应，是目前应用最为广泛的一种酶[1].在其反应过程中具有反应条件温和、耗能低、产物质量高、副反应少、对环境无污染等优点，可用于油脂加工[2]、乳品制造[3]、食品添加剂合成[4]和生产生物柴油[5]等.然而脂肪酶在应用中的一些问题限制了其使用，如寿命短、游离酶在有机相中不溶解、回收率低、产物与酶的分离困难、价格昂贵[6]等.为了解决上述问题，酶的固定化技术应运而生.壳聚糖是固定化酶的良好材料，分子中存在着丰富的羟基与氨基使其易于进行化学修饰.酶固定化方法主要有包埋法、吸附法、交联法和共价法.Aybastier等[7]利用共价法固定化脂肪酶于微孔苯乙烯-二乙烯苯聚戊二醛共聚物载体上，重复利用10批次后仅有12%的酶活损失.磁性纳米颗粒的引入，使得固定化酶的回收更加简便，Khoobi等[8]通过物理吸附和共价连接固定化脂肪酶于磁性纳米颗粒上，重复12批次后仍具有80%的活性.固定化的酶分子具有一定的游动性，更易与底物接触，使酶活性得到提高.笔者采用叠氮化方法[9]对接枝后的磁性壳聚糖进行修饰，得到叠氮化壳聚糖微球，并利用叠氮化磁性壳聚糖微球来固定化脂肪酶，以催化三丁酸甘油酯水解为催化活性的考察依据，利用响应面分析法优化固定化脂肪酶的工艺条件.固定化酶过程示意图如图1所示.
图1 固定化酶过程示意图
Fig.1 Schematic diagram of immobilized enzyme
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂
壳聚糖，脱乙酰度 ≥95%，阿拉丁 C105799；纳米Fe3O4，纯度99.5%, 20 nm，阿拉丁 I109514；丁二酸酐，纯度99%，阿拉丁 S104823；4-二甲氨基吡啶，纯度99%，阿拉丁D109207；水合肼80%，天津市天力化学试剂有限公司；猪胰腺脂肪酶 L3126，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；其他试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司.
1.1.2 仪器
分析天平AL-204，梅特勒-托利多有限公司；离心机TGL-16C，上海安亭科学仪器厂；恒温震荡箱HZ-9311K，太仓华利达实验室设备有限公司；粒度分析仪BT-9300S，丹东百特仪器有限公司；冷冻干燥机LGJ-18B，北京四环科学仪器厂有限公司.
1.2 实验方法
1.2.1 磁性壳聚糖微球的合成
将0.6 g壳聚糖与0.4 g Fe3O4溶解于冰乙酸溶液中，超声搅拌.依次将超声后的溶液、导热油和Span-80加入到特制锥形瓶中，40 ℃在恒温震荡箱中高速振荡0.5 h.滴加戊二醛进行交联反应1.5 h，然后滴加1.0 mol/L的NaOH溶液至有固体颗粒浮现，继续反应1 h，产物用正己烷和去离子水冲洗[10-11].
1.2.2 磁性壳聚糖微球改性
精确称量0.10 g的磁性壳聚糖微球加入到溶有0.6 g丁二酸酐和0.5 g 4-二甲基氨基吡啶的吡啶溶液中，45 ℃条件下搅拌反应8 h，结束后用无水乙醇冲洗干净[12]，干燥后，置于25 mL甲醇和12 mL水合肼的混合液中，50 ℃条件下搅拌反应10 h，反应结束后用0.1 mol/L的NaCl溶液冲洗干净，再加入到1 mol/L的NaNO2溶液中，反应1 h后滴加0.1 mol/L的HCl溶液，继续反应0.5 h用去离子水冲洗[13].
1.2.3 脂肪酶的固定化
将改性后的磁性壳聚糖微球置于0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液配制的脂肪酶溶液中，在不同温度下于恒温震荡箱中反应一段时间.固定化结束后用磷酸盐缓冲溶液冲洗固定化酶微球3～4次，在真空冷冻干燥箱中干燥，并在4 ℃条件下保存备用.
1.3 分析方法
1.3.1 载体微球粒径的表征
将制备的磁性壳聚糖微球真空干燥至恒重，取适量于BT-9300S激光粒度分析仪中测量其粒径分布.在显微镜下400倍放大观察其形貌.
1.3.2 载酶量的检测
将一定量的脂肪酶干粉溶解于0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，在4 ℃条件下搅拌孵化30 min，再将粗酶液用高速离心机在8 000 r/min下离心10 min，取上清液：酶溶液，采用考马斯亮蓝法[14]计算载酶量.
1.3.3 酶活性的检测
取定量的酶加入到10 mL pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，滴加1 mL的三丁酸甘油酯，在37.5 ℃下震荡反应10 min，立即加入10 mL无水乙醇，再滴加两滴酚酞试剂，充分搅拌后用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定到溶液变为粉红为止，记录下NaOH溶液消耗量.做空白实验重复上述步骤，但不加酶.计算出酶活性：
(1)
式中：V1为滴定结束后NaOH消耗量，mL;V0为空白对照组NaOH的消耗量，mL；m为固定化的酶质量，mg.
定义：在特定条件下，每分钟内产生1 μmol脂肪酸所需的酶量为一个酶活力单位.
2 结果与讨论
2.1 微球粒径表征
通过BT-9300S激光粒度测量仪测定磁性壳聚糖微球的粒径分布，结果如图2所示.从图2中可以看出，粒径分布主要集中在40～60 μm，在其他粒径区域分布的微球数量明显小于此区域.在显微镜下观察到，载体颗粒基本呈球形分布，如图3所示.
图2 粒径分布图
Fig.2 Distribution of particle size
图3 400倍显微镜下载体颗粒形貌
Fig.3 400 times the particle morphology of the microscope
2.2 响应面实验设计
通过Design-expert软件中的BBD对实验进行设计，以酶浓度(A)、反应时间(B)、反应温度(C)和pH值(D)为考察因素，确定了四因素三水平的29个实验组合，以载酶量(Y1)为响应值，考察酶负载的最优化工艺条件结果见表1.
2.3 对载酶量的分析
利用Design Expert 8.0软件对响应面设计中的响应值进行分析，得出载酶量与各考察因素之间关系式，其回归方程为：
Y1=60.52+12.02A+14.67B+1.61C+0.52D+4.2AB+1.47AC+0.25AD-0.10BC-0.25BD-0.20CD-13.93A2-13.09B2-8.05C2-8.71D2.
(2)
对方程(2)求偏导，得出最优的酶固定化工艺条件：酶浓度为4 mg/mL，反应时间为8.4 h，反应温度为39.3 ℃，pH值为7.0，酶负载量预测值为68.6 mg/g.在优化条件下，将磁性壳聚糖微球用于固定化脂肪酶，得到的酶负载量为 64.4 mg/g.
模型的方差分析如表2所示，P值是无显著影响的概率，P<0.05视为模型是显著的.该模型P值如图4所示.P<0.000 1表示模型拟合效果非常显著.从显著程度上分析各因素对载酶量的影响，影响载酶量大小的因素顺序为：反应时间>酶浓度>反应温度>pH值；两种因素的交互影响立体图从图4中也可看出，在交互项中酶浓度(A)和反应时间(B)、酶浓度(A)和反应温度(C)对酶负载量影响的交互作用较为明显.回归模型的可信度也可用复相关系数检验拟合程度，如表3中模型的复相关系数为0.997 2，表明模型与实验效果具有较好的相关性；变异系数为2.7%，表明实验操作具有较高的可靠性.
表1 响应面试验设计和结果
Tab.1 The design and results of response surface analysis
次数酶浓度/(mg·mL-1)反应时间/h反应温度/℃pH值载酶量/(mg·g-1)1-1(1)-1(1)0(37 5)0(7)12 721(5)-1(1)0(37 5)0(7)26 43-1(1)1(10)0(37 5)0(7)32 841(5)1(10)0(37 5)0(7)63 350(3)0(5 5)-1(25)-1(4)42 360(3)0(5 5)1(50)-1(4)45 370(3)0(5 5)-1(25)1(10)43 280(3)0(5 5)1(50)1(10)45 49-1(1)0(5 5)0(37 5)-1(4)23 8101(5)0(5 5)0(37 5)-1(4)49 211-1(1)0(5 5)0(37 5)1(10)26 9121(5)0(5 5)0(37 5)1(10)51 3130(3)-1(1)-1(25)0(7)22 3140(3)1(10)-1(25)0(7)53 1150(3)-1(1)1(50)0(7)25 7160(3)1(10)1(50)0(7)56 117-1(1)0(5 5)-1(25)0(7)25 3181(5)0(5 5)-1(25)0(7)47 519-1(1)0(5 5)1(50)0(7)26 2201(5)0(5 5)1(50)0(7)54 3210(3)-1(1)0(37 5)-1(4)23 8220(3)1(10)0(37 5)-1(4)53 2230(3)-1(1)0(37 5)1(10)24 3240(3)1(10)0(37 5)1(10)52 7250(3)0(5 5)0(37 5)0(7)58 8260(3)0(5 5)0(37 5)0(7)61 1270(3)0(5 5)0(37 5)0(7)61 6280(3)0(5 5)0(37 5)0(7)60 9290(3)0(5 5)0(37 5)0(7)60 2
注：括号内为实际值;括号前为水平值.
表2 回归模型的方差分析
Tab.2 Analysis of variance for selected factorial model
方差来源平方和自由度均方值F值P值显著性模型6628 3714473 45355 53<0 0001非常显著A1735 2111735 001303 00<0 0001B2581 3312581 331938 37<0 0001C31 04131 0423 310 0003D3 2013 202 410 1432AB70 56170 5652 98<0 0001AC8 7018 706 530 0228AD0 2510 250 190 6714BC0 0410 040 030 8649BD0 2510 250 190 6714CD0 1610 160 120 7340失拟项13 94101 391 180 4720不显著残差18 64141 33——
图4 交互作用的响应面立体图
Fig.4 Response surface(3D) and contour plots of operating factors
表3 模型可信度分析结果
Tab.3 The analysis result of model credibility
参数数值平均数42 4复相关系数R20 9972校正后的R20 9944变异系数/%2 7信噪比64 3
2.4 交互作用分析
酶浓度与其他3种因素相比，是影响酶负载量的最重要因素，从表2可以看出，酶浓度与反应时间的交互影响F值为52.98，酶浓度与反应温度的交互影响F值为6.53，与其他几种因素的F值相比较都较大，两者P值分别为:<0.000 1、0.022 8，说明酶浓度与反应时间和反应温度对结果的交互影响较显著.
从图4(a)可看出，当酶浓度一定时，酶的负载量随着反应时间的延长而持续增大.反应时间一定时，脂肪酶固定量随着脂肪酶浓度增加而快速增加，而当脂肪酶初始浓度大于3.3 mg/mL时，脂肪酶固定量随脂肪酶浓度增加而缓慢增加.这主要与载体表面能和脂肪酶结合的活性基团数量有关.当脂肪酶浓度低于3.3 mg/mL时，脂肪酶的量少于载体表面的活性基团，因此酶的负载量随着浓度的增大而迅速增大;当脂肪酶浓度高于3.3 mg/mL时，脂肪酶的量高于载体表面的活性基团的量，使得载酶量趋于饱和.
从图4(b)中可看出，当酶浓度一定时，反应温度对酶负载的影响并不大，只是在很小的范围内先增大后减小，这是因为随着反应温度的升高，减少了酶扩散的限制作用，使酶分子能够更快地与载体发生作用，加快固定进程.当反应温度一定时，载酶量随着酶浓度的增大先增大后减小.
2.5 重复性检测
按照得到的最优化条件酶浓度4 mg/mL，反应时间8.4 h，反应温度39.3 ℃，pH值为7.0, 对制备出的叠氮化磁性壳聚糖进行5次脂肪酶固定化重复实验，测其载酶量平均值为64.4 mg/mL，与理论预测值相接近，说明该模型可用于固定化酶实验.对制得的固定化脂肪酶进行重复性实验，即重复测定酶活实验(按照1.3.3中酶活测定方法)，反应完成后采用外加磁场的方法将固定化酶吸附到反应容器底部，与反应液分离后再加入乙醇溶液测定酶活，并以第一次测定的酶活作为初始酶活(100%).固定化脂肪酶与反应液分离后用磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，再进行重复测定.实验测得重复5次后酶活性为初始活性的75%左右，如图5所示.
图5 固定化脂肪酶重复性检测
Fig.5 Repeatability test of immobilized lipase
3 结论
(1)合成了具有磁性的壳聚糖微球并对微球进行化学修饰，引入叠氮基团交联脂肪酶，制备出回收简便的磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶.
(2)利用响应面分析法对实验条件进行优化，得出最优化的酶负载工艺条件，为脂肪酶的固定化研究找到一条新路径.
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