图1 不同质量浓度葡萄糖对SMD-Na降解的影响
Fig.1 Effects of different glucose concentrations on degradation of SMD-Na
摘 要：通过分批试验研究了葡萄糖与二价锰离子在黄孢原毛平革菌降解磺胺-5-甲氧基嘧啶钠(SMD-Na)中的作用.结果表明：未添加葡萄糖时，SMD-Na的去除率和生物量极低，当葡萄糖质量浓度在3～10 g/L时，两者随之增加,同时，SMD-Na的去除率与锰过氧化物酶活(MnP)和木质素过氧化物酶活(LiP)变化具有正相关性.当二价锰离子初始浓度为0.01～0.1 mmol/L时，SMD-Na的去除率和MnP酶活随着锰离子浓度增加而增大，锰离子浓度对LiP酶活没有显著影响.
关键词：黄孢原毛平革菌；磺胺-5-甲氧基嘧啶钠；生物降解；锰过氧化物酶；木质素过氧化物酶
黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)能产生木素过氧化物酶(Lignin peroxidase, LiP)和锰过氧化物酶(Mn-dependent peroxidase, MnP)[1]．Kirk等[2]发现限氮条件有利于LiP和MnP的产生．LiP和MnP催化反应是高度非特异性和无立体选择性的，所以黄孢原毛平革菌能有效降解多种难降解有机污染物，如多氯联苯、多环芳烃等[3]．
由于废水中磺胺类药物很难有效去除，探索其有效去除方法显得尤为重要．目前黄孢原毛平革菌降解磺胺类药物的相关研究报道较少[4-5]，本研究选择磺胺-5-甲氧基嘧啶钠(SMD-Na)作为目标物，通过摇瓶试验探究添加不同浓度的葡萄糖和不同浓度的锰离子对SMD-Na生物降解的影响，为磺胺类药物的生物降解技术的建立提供理论依据．
1.1 试剂和菌种
SMD-Na(99%)购自Sigma有限公司，色谱甲醇(99.9%)购自天津四友有限公司，双蒸水由实验室蒸馏获得，其它化学试剂为分析纯．
菌体来自实验室4 ℃保存的黄孢原毛平革菌种土豆琼脂斜面．基本培养基[6]：酒石酸铵0.2 g，KH2PO4 2 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，CaCl2 0.1 g，维生素B1 2 mg，微量元素溶液20 mL，吐温801 g，蒸馏水1 L，20 mmol/L酒石酸缓冲液调pH为5.0.微量元素溶液组成：MgSO4 3 g，MnSO4 0.5 g，NaCl 1.0 g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4 0.1 g，AlK(SO4)2·12H2O 10 mg，H3BO3 10 mg，Na2MoO4·2H2O 10 mg，蒸馏水1 L．
1.2 实验设计
1.2.1 葡萄糖质量浓度对SMD-Na生物降解的影响
在250 mL的锥形瓶里装入50 mL含10 mg/L SMD-Na的基本培养基，其中葡萄糖的浓度分别为0、3、5、10 g/L，121 ℃灭菌30 min，然后接种4%孢子悬液(1×105孢子/mL)，于30 ℃摇床里培养10 d，转速是150 r/min．
每个处理3个重复，每天测定培养基中SMD-Na的残余浓度、LiP酶活、MnP酶活、葡萄糖的剩余量、生物量等.
1.2.2 二价锰离子浓度对SMD-Na降解的影响
在250 mL的锥形瓶里装入50 mL含10 mg/L的SMD-Na、不含锰离子的基本培养基，其中葡萄糖质量浓度为10 g/L．锰离子以MnSO4形式添加，浓度分别为0、0.01、0.1和5 mmol/L．然后每瓶接入1.2.1中同样的孢子悬液，放入30 ℃的摇床中培养10 d，转速是150 r/min．每天测定SMD-Na的残余浓度、LiP酶活、MnP酶活．
1.3 方法
1.3.1 SMD-Na的测定
培养基中的SMD-Na使用高效液相色谱分析，紫外检测器检测．色谱柱：Agilent 5 TC-C18 250 mm×4.6 mm；流动相采用甲醇溶液(甲醇和二次水的体积比为30∶70)，用1%的乙酸调节pH为3.4±0.1；流速为1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温30 ℃；测定波长为278 nm[7]．利用标准曲线法对SMD-Na进行分析测定．
1.3.2 酶的测定
粗酶液提取：培养液过滤后取滤液在转速12 000 r/min下离心20 min，取上清液即为粗酶液，在4 ℃冰柜中保存备用．
LiP[6]：反应混合物(4 mL)含2 mmol/L藜芦醇、0.4 mmol/L过氧化氢和50 mmol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液(pH 2.5)以及1 mL粗酶液，在恒温水浴锅中维持30 ℃条件下反应，用紫外分光光度计检测310 nm处2 min内吸光度值的变化．定义每分钟氧化1 μmol藜芦醇成藜芦醛所需的酶量为1个酶活力单位．
MnP[8]：反应混合物(4 mL)含0.1 mmol/L硫酸锰、0.1 mmol/L过氧化氢和100 mmol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液(pH 5.0)以及1 mL粗酶液，在恒温水浴锅中维持30 ℃条件下反应，用紫外分光光度计检测238 nm处10 s内吸光度值的变化．定义每分钟氧化1 μmol Mn2+为Mn3+所需的酶量为1个酶活力单位．
1.3.3 其它测定
菌体生物量：干重法测定[9]；还原糖：3,5-二硝基水杨酸法测定[10]．
2.1 不同葡萄糖质量浓度对SMD-Na生物降解的影响
在限氮条件下研究不同质量浓度的葡萄糖对SMD-Na生物降解的影响，结果如图1所示．在葡萄糖存在下，SMD-Na的浓度随着时间的延长不断减小，而未添加葡萄糖的对照中SMD-Na浓度下降幅度极小，说明黄孢原毛平革菌在葡萄糖存在下可以降解SMD-Na．随着葡萄糖初始质量浓度的增大，第10 d SMD-Na的剩余浓度分别为7.21、5.00和2.55 mg/L，说明在一定范围内葡萄糖质量浓度的增加促进了SMD-Na的生物降解．
图1 不同质量浓度葡萄糖对SMD-Na降解的影响
Fig.1 Effects of different glucose concentrations on degradation of SMD-Na
图2为各物质随时间的变化曲线，从图2(c)和图2(d)中可以看出，随着培养时间的延长，不同水平的葡萄糖质量浓度在不断下降，黄孢原毛平革菌的生物量在逐渐增加，表明黄孢原毛平革菌以葡萄糖为碳源和能源进行生长．随着葡萄糖质量浓度的增加，黄孢原毛平革菌生长速率逐渐增加，在第6 d，各生物量均达到最大，随之生长进入稳定期．未添加葡萄糖的对照中磺胺-5-甲氧基嘧啶钠的去除率很低，并且黄孢原毛平革菌生物量增加幅度很小，表明黄孢原毛平革菌难以利用磺胺-5-甲氧基嘧啶钠为唯一碳源和能源进行生长代谢．而当生长基质葡萄糖存在时，黄孢原毛平革菌以共代谢的方式降解了SMD-Na．
微生物体内某些关键酶是共代谢过程发生的关键因素[11]．从图2(a)中可以看出，在不同葡萄糖质量浓度下，MnP活性变化规律大致相同，即第4 d酶活开始出现，之后增大，于第6 d达到最大值，随后开始下降；同样条件下，LiP活性于培养的第1 d便出现，然后保持稳定，第6 d后开始缓慢减小(图2(b))．随着葡萄糖质量浓度的加大，两种酶活均有增加，SMD-Na降解率也随之增加，表明两种过氧化物酶均参与了SMD-Na的共代谢．在未加葡萄糖的对照中，两种酶活均未检出，表明菌体生长是该酶系合成的前提条件．当葡萄糖质量浓度为10 g/L时，MnP在培养的前3 d内未检出，而LiP活性又很低，但SMD-Na去除率在前3 d内较高，推测其它酶有可能参与了SMD-Na的降解，在前期，本研究通过添加P450酶抑制剂1-氨基苯并三唑证明在黄孢原毛平革菌降解SMD-Na中，P450酶也参与其中(数据未显示)．由此，葡萄糖在菌株对SMD-Na降解过程中起到了共代谢的作用．
图2 MnP酶活、LiP酶活、葡萄糖剩余浓度及生物量干重随时间的变化曲线
Fig.2 Dynamic curves of the activity of MnP, LiP， residual glucose and dry biomass
2.2 不同浓度锰离子对SMD-Na生物降解的影响
图3为不同浓度锰离子对SMD-Na降解的影响，从图3中可以看出，当锰离子浓度由0.01 mmol/L增加至0.1 mmol/L时，SMD-Na的降解率由74.5%增加至92%．当锰离子浓度大于0.1 mmol/L时，SMD-Na的降解率变为58%，对照组中SMD-Na的降解率最小．结果表明，一定量的二价锰离子可以促进SMD-Na的生物降解，而较高浓度的锰离子会对微生物产生一定的毒害作用从而抑制SMD-Na的生物降解．
图3 不同浓度锰离子对SMD-Na降解的影响
Fig.3 Effects of different Mn(Ⅱ)concentrations on degradation of SMD-Na
MnP可以氧化Mn2+为Mn3+，氧化木质素及/或异生质[12]．本研究中在不含Mn2+的对照中，未检测出MnP，在0.01～0.1 mmol/L浓度范围内，MnP酶活随着Mn2+浓度增加而增加，当锰离子浓度继续增加时,MnP酶活却下降,锰离子对MnP和LiP酶活的影响如图4所示．从图4(b)中可以看出，不同锰离子浓度对LiP酶活没有显著影响．依据LiP酶活的大小以及不同Mn2+浓度下LiP酶活与SMD-Na降解率变化趋势的对应性，推测LiP在SMD-Na降解中作用较小．
图4 锰离子对MnP和LiP酶活的影响
Fig.4 Effect of Mn(Ⅱ)on the activity of MnP and LiP
(1)葡萄糖质量浓度的增加提高了SMD-Na的生物降解率.MnP和LiP均参与了SMD-Na的降解转化，其中MnP酶作用大于LiP酶.
(2)Mn2+是MnP催化活性所必须的，0.1 mmol/L的Mn2+有助于增加MnP酶活，从而提高SMD-Na降解率.另外，不同浓度Mn2+对LiP没有显著影响.
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Abstract：The effects of various concentrations of glucose and Mn(Ⅱ) on degradation of sulfametoxydiazine sodium (SMD-Na) byPhanerochaete chrysosporium were investigated through batch experiments. The results showed that the degradation efficiency of SMD-Na and the fungal biomass were very low without glucose and increased with the rise glucose concentration from 3 g/L to 10 g/L. At the same time, the SMD-Na biodegradation had the positive relevance of manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP). The removal efficiency of SMD-Na and MnP activity increased with the rise Mn(II) concentration from 0.01 mmol/L to 0.1 mmol/L. However, the Mn(II) concentration had no significant effect on LiP.
Key words：Phanerochaete chrysosporium; SMD-Na biodegradation; Mn-dependent peroxidase; lignin peroxidase
文章编号：1671-6833(2017)01-0032-04
收稿日期：2016-04-25；
修订日期：2016-06-18
基金项目：国家水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX07204-002)
中图分类号：X703.1
文献标志码：A
doi：10.13705/j.issn.1671-6833.2016.04.021